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古朵技術:細胞凍存與復蘇詳細解答!

發布時間:2020-08-03瀏覽次數:2669返回列表

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于 - 196℃液氮中低溫保存,可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來,這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞,可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,起到了細胞保種的作用。


一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時,細胞內和外環境中的水都會形成冰晶,能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快,使之迅速通過細胞易受損的-5~0℃,細胞仍能生長,活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細胞無-毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞。

二、細胞凍存與復蘇操作步驟
(一)凍存
1、消化細胞(同實驗二),將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm 離心 10 分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養,計數,調整至 5×106/ml 左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管 1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴,否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽,寫明細胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20 分鐘)→冰箱冷凍室(30 分鐘)→低溫冰箱 (-30℃ 1 小時)→氣態氮(30 分鐘)→液氮。
注意:操作時應小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時補充,不能揮發干凈,一般 30 立升的液氮能用 1~1.5 月。

(二)復蘇
1.  細胞實驗室進行常規消毒,紫外照射 40min 以上。
2.  培養液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱 37°C 預熱 20min,備用。
3.  二甲基亞砜(DMSO) 在 40°C 冰箱中冷藏 30min,備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管,立即放入 400°C 水浴中,快速搖晃,直至凍存液完全融化。
5.  將細胞懸液移入 15ml 離心管,緩慢加入 4ml 培養液,離心(1000r/min,5min)。
6.  用培養液懸液混懸沉淀細胞,調整細胞濃度,方培養箱中培養。

7.  記錄復蘇日期。
三、注意事項
1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套,護目鏡。此項尤為重要,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸。
2.  凍存液的問題:凍存液的配置已是常識,在這里不作詳述,但二甲基亞砜(DMSO)對細胞不是完全無-毒副作用,在常溫下,二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大,因此,必須在 1-2min 內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢,會造成細胞的損傷,二甲基亞砜(DMSO)選擇進口產品。
3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養液可稀釋其濃度,以減少對細胞的損傷。
4.  離心問題:目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養,第二天換液。因為離心的目的是兩個,去除 DMSO,去除死細胞,這個是標準流程,但對一般人來說,把握不好離心轉速和時間,轉的不夠活細胞沉底的少,細胞就全被扔掉了,轉過了活細胞會受壓過大, 死亡。此外在操作過程中容易污染,所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜(DMSO),DMSO 對細胞有一定的毒副作用,所以須將離心后的液 體前倒凈,且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇,結果無有異常。
5.  細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時 1ml 細胞液要加 10ml-15m 培養液,而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
6.  復蘇細胞分裝的問題:試驗中我的經驗總結為復蘇 1 管細胞一般可分裝到 1-2 只培養瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。
7.  加培養基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是 DMSO 的濃度,從如果你加培養基的太少,那么 DMSO 的濃度就會比較大,就會影響 細胞生長,從以前的資料來看,DMSO 的濃度在小于 0.5% 的時候對一般細胞沒有什么影響,還有一個說法是 1%。所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO 的話那么加 10ml 以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度

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